| 普魯士、奧地利兩國共同出兵丹麥之時，已經是各懷鬼胎，到戰後處理丹麥問題時，越演越烈。奧地利主張什勒斯維希（Schleswig）和霍爾斯坦（Holstein）兩地另組一邦加入日耳曼邦聯。但是俾斯麥認為這樣等於幫助奧地利增加一個傀儡政權以及替未來的民族統一造成障礙，遲遲不願同意，實際上普魯士希望能將兩地納為己有。為了避免國際干涉，最後於1865年的加斯坦協約（Gastein Convention），達成妥協，兩地由普魯士與奧地利分別統治。 |
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| 俾斯麥一面運用奧國在處理匈牙利問題時所面臨的困境，一面在國際展開孤立奧地利的政治手腕。英國此時的政策是不過問歐陸事務；俄國則是處理自己的內政問題而無暇他顧；使歐陸局勢掌握在法國的手上。1865年10月俾斯麥會晤拿破崙三世，俾斯麥口頭承諾只要法國採取中立，未來將提供比利時或是萊因區作為補償。1866年，普魯士御前會議決議與奧地利開戰，但是必須完成兩個前提：一是有利的歐洲國際局勢；二是德意志地區境內人民的支持。為了完成兩項前提，更與義大利（薩丁尼亞王國）訂立攻守同盟。
俾斯麥在外積極孤立奧國時，亦考慮到國內的情況。人民對於俾斯麥將霍爾斯坦「贈與」奧國感到極大的不滿，更有人認為俾斯麥是賣國賊，甚至暗殺他，幸好並未傷及要害。另一方面，國王雖然支持進行戰爭，但議會卻反對。國王再一次踐踏憲法，強行解散國會。軍隊亦制定出周密的作戰計劃，各種物資的準備也全部完成。最後，只要等待一條導火線。 |
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 ■圖片說明：薩多瓦（Sadowa）會戰：歐洲戰爭史上到第一次世界大戰之前這是一次性投入兵力最多的戰役
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| | 俾斯麥與奧地利境內的分裂份子接觸，並在日耳曼邦聯中提議由國民普選的國民會議來改革日耳曼邦聯。奧地利完全無法接受，藉著掌握日耳曼邦聯的多數展開反擊，於是普魯士宣布日耳曼邦聯已遭奧地利破壞，戰爭全面爆發。1866年5月，威廉一世下令全國總動員，於6月宣戰。基於攻守同盟條約，義大利亦加入普奧戰爭。普魯士軍隊戰備優良、戰略得宜，在參謀總長毛奇（Moltke，1800-1891）策劃下，7月3日薩瓦多（Sadowa）會戰，大敗奧軍。奧地利不僅是面對普魯士的威脅，還受到義大利的牽制，部分軍力被牽制在阿爾卑斯山以南，縱然義大利境內的戰爭多為勝利，但是面對普魯士的節節進逼，這場戰爭七週後結束，奧軍潰不成軍，被迫求和。自薩多瓦戰役後，普軍節節勝利，國王威廉一世及總參謀長毛奇主張乘勝追擊，但俾斯麥堅持結束戰爭。俾斯麥明白在這場戰爭的勝利中，已得到他們所需的——把奧地利的勢力趕出德意志。如繼續向奧進迫，只會令奧國移向支持法國，令普魯士兩面受敵，圓滑地與奧講和，便可避免這種情況的發生。 |
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| | 俾斯麥與奧地利簽訂尼古斯堡和平草約（Preliminary Peace at Nikolsburg）：漢諾威、郝斯、那騷以及法蘭克福併入普魯士，奧地利被排除出德意志，並且取消了日耳曼邦聯；馬恩河以北各邦在普魯士的領導下組成北德邦聯，南德各邦則是保持獨立並可以組成單獨的同盟。北德邦聯的憲法出於俾斯麥的設計，一方面利用普選爭取工業家、財政家等階級的支持，另一方面也藉保守的農民對抗城市的自由份子，達成北德邦聯實際上亦是以普魯士為宗的新國家。對奧戰爭結束後，國王威廉一世和俾斯麥一同回國，受到熱烈的歡迎。這場普奧戰爭令俾斯麥在一夜間受到各階層的歡迎，反對勢力銳減。同時，在普奧戰爭後，德意志地區境內民族主義的浪潮日益高漲，取代自由主義的地位。 |
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